生命學(xué)院陳春來(lái)課題組建立一種基于熒光蛋白熒光壽命的檢測(cè)方法
清華新聞網(wǎng)4月3日電 在神經(jīng)退行性疾病研究領(lǐng)域，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)多種致病蛋白能夠通過(guò)液液相分離機(jī)制形成動(dòng)態(tài)的液態(tài)凝聚體。這些生物分子凝聚體會(huì)隨著時(shí)間推移經(jīng)歷液-固相變過(guò)程，最終轉(zhuǎn)化為病理性的固態(tài)聚集體。當(dāng)前研究中廣泛采用的FRAP（熒光漂白恢復(fù)）技術(shù)雖然能夠有效評(píng)估液態(tài)凝聚體的流動(dòng)性特征，但無(wú)法對(duì)流動(dòng)性進(jìn)行非破壞性的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)表征和可視化追蹤，這一技術(shù)瓶頸在相關(guān)研究中普遍存在，亟待新型檢測(cè)方法的突破。
3月31日，清華大學(xué)生命學(xué)院陳春來(lái)課題組在《物理化學(xué)快報(bào)》（The Journal of Physical Chemistry Letters）發(fā)表題為“利用熒光蛋白的熒光壽命探究FUS凝聚體的形成及液-固相變”（Probing the Formation and Liquid-to-Solid Transition of FUS Condensates via the Lifetimes of Fluorescent Proteins）的研究論文，成功建立了一種基于熒光蛋白熒光壽命的檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)FUS凝聚體從液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)過(guò)程中內(nèi)部流動(dòng)性的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)表征。
熒光壽命為熒光分子在激發(fā)態(tài)的停留時(shí)間。因其對(duì)分子微環(huán)境的高度敏感性，且不受熒光強(qiáng)度波動(dòng)或光漂白效應(yīng)干擾的特性，為生物分子凝聚體的動(dòng)態(tài)研究提供了新思路。研究人員創(chuàng)新性地提出利用FLIM（熒光壽命顯微成像）技術(shù)表征蛋白質(zhì)凝聚體內(nèi)部流動(dòng)性的研究策略。
研究人員通過(guò)GFP標(biāo)記技術(shù)追蹤FUS蛋白的相變過(guò)程，可以觀察到隨著蛋白凝聚體從液態(tài)向固態(tài)轉(zhuǎn)變，GFP熒光壽命呈現(xiàn)明顯的漸進(jìn)式下降。該研究揭示了一個(gè)重要的分子特征：蛋白凝聚體流動(dòng)性的變化可以通過(guò)熒光壽命這一指標(biāo)進(jìn)行精確監(jiān)測(cè)。研究團(tuán)隊(duì)特別關(guān)注了FUS突變體G156E形成的獨(dú)特“星爆”結(jié)構(gòu)。通過(guò)FLIM成像分析發(fā)現(xiàn)，該結(jié)構(gòu)的中心區(qū)域與外圍纖維區(qū)域展現(xiàn)出截然不同的熒光壽命特征（圖1）。后續(xù)結(jié)合透射電子顯微鏡和偏振光顯微鏡的聯(lián)合分析證實(shí)，熒光壽命的差異很可能反映了兩個(gè)區(qū)域在分子結(jié)構(gòu)排列上的區(qū)別。
圖1.GFP標(biāo)記的FUS-G156E形成的凝聚體流動(dòng)性（A）和GFP熒光壽命（B和C）隨液-固相變降低
隨后，研究人員系統(tǒng)性地評(píng)估了多種實(shí)驗(yàn)室常用熒光蛋白在液液相分離和液-固相變過(guò)程中的熒光壽命特性，為相關(guān)研究提供了重要的工具選擇依據(jù)。研究人員還進(jìn)一步評(píng)估了mEYFP中調(diào)節(jié)熒光壽命敏感度的關(guān)鍵氨基酸殘基，獲得了靈敏度較原始版本顯著提升mEYFP的突變體（圖2）。
圖2.mEYFP突變體示意圖（A）及其在液-固相變過(guò)程中的熒光壽命（B）
通過(guò)結(jié)合藍(lán)光誘導(dǎo)相分離的optoDroplet系統(tǒng)，研究人員在活細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對(duì)FUS蛋白凝聚體液-固相變過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，驗(yàn)證了該技術(shù)在活細(xì)胞中的適用性。該研究為深入理解神經(jīng)退行性疾病中蛋白質(zhì)異常聚集的分子機(jī)制提供了強(qiáng)有力的研究工具（圖3）。
圖3.mCherry熒光壽命隨optoFUS顆粒從液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)逐步降低
清華大學(xué)生命學(xué)院副教授陳春來(lái)與清華大學(xué)細(xì)胞影像平臺(tái)主管王文娟工程師為論文共同通訊作者。清華大學(xué)生命學(xué)院2018級(jí)博士生季瑾瑤為論文第一作者。清華大學(xué)生命學(xué)院博士后徐魁參與研究。項(xiàng)目得到國(guó)家自然科學(xué)基金委、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、北京市生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心、膜生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的支持。
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