農桿菌T-DNA介導實現高效DNA定向插入
華南農業大學生命科學學院副教授胡宇飛課題組在國家自然科學重點基金等項目的資助下，在擬南芥中利用CRISPR/Cas9介導實現轉移DNA（T-DNA）的高效定點插入，并開發出兩種應用。近日，相關成果發表于《植物雜志》（Plant Journal）。
CRISPR/Cas9介導的T-DNA定點插入。研究團隊供圖
位點特異性DNA插入（site-specific DNA insertion）是作物育種和基因功能分析的重要工具，可以將功能性元件插入特定基因組位點，并可以避免插入基因在染色體不同位置所帶來的表達差異。在過去幾十年里，許多努力未能實現令人滿意的效率。
傳統的位點特異性DNA插入方法基于同源重組修復機制，然而，植物細胞中同源重組修復的低活性使得需要多個世代，篩選大量后代，因而低效。與同源重組修復介導的插入低效相比，農桿菌介導的T-DNA整合效率高，是植物遺傳工程的主要手段。然而，T-DNA整合依賴非同源末端連接途徑，在植物基因組中的插入位點具有隨機性。
該研究開發了一種CRISPR/Cas9介導的擬南芥靶向T-DNA插入的方法。該方法比同源重組修復介導的方法更快速、高效，并以此開發了基因激活和雄性生殖細胞特異性基因標記兩種應用。基因激活通過在T-DNA的LB端設置CaMV35S啟動子，定點插入激活特定的下游基因。利用該技術實現了FT和MYB26的激活，顯著增加了轉錄表達，分別導致早花和花藥內壁次生壁增厚模式的改變。
雄性生殖細胞特異性基因標記的T-DNA中包含兩個報告基因，即NeoR和MGH3::mCherry，有助于創建定點插入突變體，簡化突變等位基因的遺傳分析，并可對受精過程的生殖細胞進行活體追蹤。該研究成功地將該系統應用于靶向精細胞特異表達，參與精卵識別的基因GEX2。
相關論文信息：https://doi.org/10.1111/tpj.70104
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