生命科學(xué)學(xué)院季雄團(tuán)隊(duì)提出FeaSion策略揭示RNA聚合酶磷酸化的特征調(diào)控與功能
RNA聚合酶II的經(jīng)典研究主要集中于其C末端結(jié)構(gòu)域（CTD）。CTD上高頻率的磷酸化修飾（如Y1, S2, T4, S5, S7）被認(rèn)為調(diào)控了轉(zhuǎn)錄全過程及共轉(zhuǎn)錄事件，但其因果機(jī)制大多不明。由此產(chǎn)生的“RNA聚合酶密碼”假說——即不同磷酸化位點(diǎn)通過招募特異因子行使獨(dú)特功能——雖極具吸引力，卻缺乏實(shí)質(zhì)性證據(jù)。另一方面，盡管CTD相關(guān)的激酶與磷酸酶（如CDK7, CDK9, PP2A, PP1）在發(fā)育與疾病中的作用已被確認(rèn)，但當(dāng)前研究主要局限于少數(shù)經(jīng)典因子，對整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)知仍存在顯著空白。
2025年11月28日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心季雄課題組在Science Advances期刊在線發(fā)表題為“FeaSion decodes the regulatory landscape and functional diversity of RNA polymerase II CTD phosphorylation”的研究論文。該研究提出“FeaSion”策略（Feature-Screening-Function），系統(tǒng)解析了RNA聚合酶II CTD磷酸化的特征、調(diào)控因子及功能。課題組通過位點(diǎn)特異性突變體瞬時(shí)置換技術(shù)，證實(shí)不同磷酸化位點(diǎn)調(diào)控特定轉(zhuǎn)錄過程、組蛋白修飾以及發(fā)育/信號(hào)通路相關(guān)基因。基于全基因組CRISPR篩選與流式分選，鑒定出115個(gè)潛在調(diào)控RNAPII磷酸化的激酶/磷酸酶（多數(shù)與癌癥相關(guān)）；對篩選中112個(gè)因子進(jìn)行驗(yàn)證，陽性率高達(dá)94%，表明篩選結(jié)果具有高置信度。最后證實(shí)，激酶CLK1/4與YES1除已知經(jīng)典功能外，能夠直接通過調(diào)控RNAPII磷酸化，控制特定發(fā)育、代謝與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)。
論文截圖
研究人員首先利用高質(zhì)量的CTD磷酸化抗體，通過ChIP-seq對5種磷酸化的RNAPII在基因組中的分布進(jìn)行了繪制。結(jié)果顯示不同磷酸化位點(diǎn)在基因上的定位模式存在明顯差異，各個(gè)磷酸化位點(diǎn)偏好結(jié)合的基因在長度、外顯子數(shù)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等基因組特征上具有特異性。同時(shí)，結(jié)合ChIP-MS質(zhì)譜分析，不同CTD磷酸化的RNAPII在染色質(zhì)上的互作蛋白具有模塊化的特點(diǎn)，且不同磷酸化形式關(guān)聯(lián)于獨(dú)特的生物學(xué)過程，說明CTD磷酸化的RNAPII不僅與轉(zhuǎn)錄相關(guān)，還參與了染色質(zhì)上的各項(xiàng)調(diào)控。
緊接著，研究人員創(chuàng)新性地構(gòu)建了一個(gè)基于染色質(zhì)流式技術(shù)的CRISPR-FACS功能篩選平臺(tái)，使用不同CTD磷酸化的特異性抗體，將全基因組的CRISPR敲除文庫細(xì)胞進(jìn)行通透、固定之后標(biāo)記上熒光，并通過熒光信號(hào)的強(qiáng)弱區(qū)分出可能導(dǎo)致磷酸化水平上調(diào)或下調(diào)的基因。此后通過FACS分選與基因組二代測序，研究人員篩選出了影響各位點(diǎn)磷酸化水平的調(diào)控因子，并提示了RNAPII CTD磷酸化與腫瘤等疾病狀態(tài)的密切聯(lián)系，大大擴(kuò)充了已知的RNAPII CTD磷酸化的調(diào)控圖譜。同時(shí)這一策略也為后續(xù)開展其他蛋白質(zhì)的其他翻譯后修飾的調(diào)控因子篩選提供了可借鑒的研究策略。
為了研究各個(gè)CTD磷酸化位點(diǎn)的功能，研究者們首先通過慢病毒過表達(dá)以及CRISPR基因敲除，將細(xì)胞內(nèi)的RNAPII全部替換為帶有dTAG降解標(biāo)簽的RNAPII，從而實(shí)現(xiàn)對RNAPII蛋白的快速降解。此后研究者們又分別在這一細(xì)胞系內(nèi)構(gòu)建了由Tet-on啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的5個(gè)不同CTD磷酸化位點(diǎn)的突變體細(xì)胞系（Y1F、S2A、T4V、S5A和S7A，同時(shí)使用野生型RNAPII作為陰性對照）。在這些突變體細(xì)胞系中加入Dox和dTAG小分子就可以實(shí)現(xiàn)RNAPII的位點(diǎn)特異性瞬時(shí)替換。利用這一瞬時(shí)替換系統(tǒng)，研究者們通過轉(zhuǎn)錄組、表觀組以及蛋白組學(xué)方法，揭示了各個(gè)CTD磷酸化與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因表達(dá)以及染色質(zhì)修飾之間的聯(lián)系。該系統(tǒng)同樣具有廣泛適配性，為未來解析蛋白翻譯后修飾的功能提供了有力的方法工具。
綜合FeaSion策略，研究者們最終鎖定到了3個(gè)具有位點(diǎn)特異性調(diào)控作用的激酶：CLK1、CLK4和YES1，并通過生化實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其對RNAPII CTD的直接磷酸化功能。后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證明，這些激酶可以直接結(jié)合在染色質(zhì)上并調(diào)控基因特異性的RNAPII磷酸化。
RNAPII CTD磷酸化位點(diǎn)研究的FeaSion策略
總而言之，本研究首次從全局的視角解析了RNAPII各磷酸化位點(diǎn)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和功能特性，為轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究提供了新的理解。同時(shí)FeaSion平臺(tái)作為一種普適的研究框架，可推廣應(yīng)用于其他蛋白翻譯后修飾的功能圖譜繪制，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控和疾病研究領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
季雄為該論文的通訊作者。生命科學(xué)學(xué)院博士生朱峻毅和包麗君為該論文的共同第一作者。北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士生徐圣淳、北京大學(xué)鳳凰工程中心的多個(gè)儀器平臺(tái)對該研究提供了重要幫助。
季雄課題組長期從事RNA聚合酶非經(jīng)典調(diào)控功能研究。主要集中在RNA聚合酶自身的分子機(jī)理、疾病與治療等方向，近年成果發(fā)表在Cell（2023）、Molecular Cell（2022，2023）、Nature Communications（2022，2025）、Science Advances（2025）、Nucleic Acids Research （2023，2024，2025）、Genome Biology（2020，2022）、Cell Reports （2023）、Cell Discovery（2020）等雜志上，為選擇性基因表達(dá)調(diào)控提供新的假說。歡迎感興趣的博士后和研究生聯(lián)系并申請加入。
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